常见问题解答 Q&A

     

1、什么是PCR技术？

      PCR 技术（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，用于扩增DNA序列。PCR 技术        通过模拟自然DNA复制过程，在体外通过特定的酶和引物体系，将目标DNA序列扩增。

 

 

2、传统PCR是如何进行扩增的？ 

      A、变性（Denaturation）：将混合反应体系加热至约94-98摄氏度，使DNA双链分离成两条单链。

      B、引物结合（Annealing）：将反应体系降温至引物特异性结合的温度（通常为50-65摄氏度），使引物与目标DNA序列的两端                  结合。

      C、延伸（Extension）：在约72摄氏度下，DNA聚合酶沿着模板DNA链合成新的DNA链，从引物的3'末端开始延伸，形成双链                   DNA。

 

 

 

3、qPCR反应原理是什么？

      qPCR的CT值其实是循环数，qPCR检测一个CT就是一个循环，实际上就是目的片段2倍扩增，1→2，2→4，4→8，8→16......

 

4、什么是定量PCR的CT值？

      PCR的CT值（Cycle Threshold Value）是在聚合酶链反应（PCR）过程中的一个重要指标，用于衡量目标序列在反应中的丰度或浓        度。CT 值表示在PCR反应的几个循环（cycle）后，荧光信号首次超过设定的阈值（threshold）值的循环数。

  

 

5、什么是LAMP技术？

      环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，简称为LAMP）是一种用于DNA扩增的分子生物学技术，具有        以下特点和优势：
     

      1.等温扩增：LAMP 技术在恒温条件下（通常在60-65摄氏度），利用DNA聚合酶和特定的引物体系，可以迅速、高效地扩增目标            DNA序列。与传统PCR技术不同，它不需要复杂的温度循环设备。
      2.高效率和快速：由于是在恒温条件下进行，LAMP 可以在相对较短的时间内（通常在30分钟到1小时内）完成扩增过程，适合于需           要快速检测的应用场景。
      3.直接可视化：LAMP 反应产生的大量DNA产物可以通过肉眼或简单的荧光检测装置直接观察，无需进一步分析。
      4.应用广泛：LAMP 技术在医学诊断、环境监测、食品安全等领域有着广泛的应用，特别是在资源匮乏地区或者需要快速检测的现             场应用中，具有重要意义。
     

      总之，环介导等温扩增技术因其简单、快速、高效和低成本的特点，成为了现代分子生物学中重要的一种DNA扩增技术，推动了            分子诊断和疾病监测领域的进步。

 

6、什么是HmPCR™平台？

      HmPCR™平台是善本生物基于LAMP技术而研发出的用于核酸快速检测的一个技术综合体。该平台技术通过基因工程改造关键酶制          剂和使用世界上最先进的冻干技术有效解决了实验室LAMP技术的瓶颈问题。该技术开发的产品适用于核酸的快速扩增，使用时只          要将核酸裂解产物加到冻干的酶制剂混合物中，通过环介导等温扩增反应在恒温下进行反应。

 

 

 

7、HmPCR™平台同传统实验室LAMP的对比优势是什么？

 

 

 

8、冻干技术的原理是什么？

      冻干技术，也称为冷冻干燥技术，其原理是利用升华过程将物质中的水分去除，以达到干燥和保存的目的。冻干技术的关键在于控          制温度、压力和时间，以实现高效干燥，同时尽可能保持物质的原始特性，如结构、营养成分、活性成分和风味等。

  

 

 

9、冻干技术的优势是什么？

      让试剂常温保存，摆脱了冷链运输以及冷藏冷冻保存的局限性；快速复水活化，省去了传统试剂长时间反应的过程；多种试剂共存          于同一冻干微球种。

 

 

 

10、什么是裂解液？ 

       裂解液，又叫细胞破裂液，是一种化学试剂，其主要作用是破坏生物细胞的结构，使得细胞组织中的细胞膜和细胞壁被破裂，细胞           内部的生物大分子得以释放出来。这些生物大分子包括DNA、RNA等物质等，是进行分子生物学实验的主要物质。

 

 

 

11、裂解液是由什么组成的？

         A、洗涤剂：例如各种离子性（如SDS）、非离子性（如Tween-20）、去垢剂（如 Triton X-100）等，用于破坏细胞膜和脂质                     层，使细胞内容物释放到溶液中。

         B、蛋白质酶抑制剂：用于防止蛋白质降解，常见的抑制剂包括 PMSF（苯甲磺酰氟化物）、EDTA（乙二胺四乙酸）等。

         C、还原剂：如DTT（二硫苏糖醇）、β-巯基乙醇等，用于保持蛋白质的还原状态。

         D、其他添加剂：根据具体实验需要，可能还会添加氧化还原剂、金属离子螯合剂等。

         裂解液的设计取决于样品的类型和后续分析的目的。例如，对于蛋白质分析，通常会选择含有较高浓度的洗涤剂和蛋白质酶抑                 制剂的裂解液，以确保有效地裂解细胞并保护蛋白质不被降解。对于DNA或RNA的提取，可能会选择适合DNA或RNA保护和                 释放的裂解液配方。总之，裂解液在生物学实验中是一个基础而关键的试剂，能够有效地提取和释放细胞内的目标生物分子，                 为后续的实验操作提供必要的前处理步骤。

 

 

 

12、开口试剂为什么要冷冻保存？

         试剂开口之后就打破它的密封状态，从而与外界环境直接接触，而外界环境中空气中有水蒸气，可以进入管中溶解冻干微球，从而           影响冻干微球的使用效果。

 

 

 

13、滴加样本时为什么不能多加?

         实验体系中各个试剂的加量是确定的，已经配置完成，如果多加样本，会导致反应体系的破坏，达不到最优反应体系从而影响反应           结果。

 

 

 

14、市面上出现有4通道的PCR设备含4种主流非瘟基因型，宣传其可以分型。善本的HmPCR能否实现？

         善本的非瘟试剂用的是非瘟保守区的核心基因片段，变异的亦可检出。从检测实践出发，除首次检测确定应对策略时分型有意义，           常规检测没有必要分型。善本的“多边形战士”能涵盖所有非瘟基因型，对协防非瘟更有价值。

 

 

 

15、稀释液的作用是什么？

         实验结果是通过检测荧光来读取结果的，如果样本看起来比较干净，可直接加到裂解液进行裂解。如果样本浑浊度比较高，建议先           用稀释液稀释，降低其浑浊度，从而不影响后续的实验结果。

 

 

 

16、为什么善本的设备常规检测不需要加阳性对照？

         阳性对照是保证实验结果准确，确认试剂、仪器、操作没有问题。常规液体试剂需要反复冻融来进行操作，且操作要求高，加阳性           对照防止操作、试剂出现问题。而我们的试剂是全组份冻干试剂，不需要配置体系就可直接使用，且体系方便操作。所以在确认             试剂没有问题之后不用每次加阳性对照。

 

 

 

17、什么情况必须要做阴、阳性对照？

         仪器和试剂收到之后，确保仪器和试剂没有问题，可做阴、阳性对照进行测试。或者试剂长时间未使用之后，确保试剂没问题可做           阴、阳性对照。

 

 

 

18、什么是通道和通量？

         1.通道是指荧光PCR仪器中的荧光检测通道，单通道只有一种颜色的荧光，一管反应试剂里面只能测到一种颜色的荧光，也就是一              种疾病；多通道含有多种颜色的荧光，可在一管反应试剂里面检测多种疾病。

         2.通量是指检测仪器能够同时检测样本的最大量，比如说16孔仪器的最大通量就是能检测16个样本。

 

 

19、样本是封口的，仪器是通过什么原理检测出结果？

         反应试剂加样之后需要盖上管盖不能打开，管壁是透明的，仪器主要通过管底的荧光检测通道来检测荧光值得出结果。

 

 

 

20、CT值在38以上表明样本的病毒含量低，为什么不能确保每次都检出阳性？

         因为CT值38以上的病毒含量是极低的，因为原始样品的核酸或提取的核酸都会因为运输、操作或保存不当有不同程度的降解，再             加上每次操作可能不太一样，所以不能确保每次都检出阳性。

 

 

 

21、什么是内参？内参起到什么作用？为什么善本的LAMP试剂不需要内参？

         内参即是内部参照基因，它在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。比如说做猪病检           测的时候加入内参（猪的某个基因），采集猪的样本做检测，哪怕检测疾病是阴性，内参基因是一定会出现阳性。如果说内参基因           没有出现阳性，那么代表检测是有问题的。但环境样品检测之后内参是阴性的，因为内参是根据猪身上的基因设计引物的。

 

 

 

22、什么是多联检测？

         多联检测（Multiplex Testing）是一种在同一个实验中同时检测多个目标（如病原体、基因、蛋白质等）的方法。通过这种技                 术，可以在一次检测中获得多种信息，节省时间和资源。多联检测广泛应用于临床诊断、公共卫生监测、食品安全检测和科研等领           域。

 

 

 

23、什么是假阳性？

          假阳性（False Positive）指的是在检测或诊断过程中，测试结果显示某个目标或条件存在，但实际上目标或条件并不存在的情                况。这种错误的阳性结果可能会导致误诊、错误的治疗或不必要的担忧。假阳性问题在各种检测方法和领域中都可能出现，包括              医学诊断、环境监测、质量控制等。

 

 

24、产生假阳性的原因是什么？

         A、检测方法的固有缺陷：特异性不足，检测方法无法完全区分目标物与其他类似物质，导致非目标物质被误判为目标物。

         B、样本污染：样本在采集、处理或检测过程中受到其他样本或环境中的污染，导致结果异常。

         C、设备污染：检测设备或器具未充分清洁，导致残留物影响检测结果。

         D、试剂问题：试剂质量不佳：使用劣质或失效的试剂可能会导致错误的结果。

               试剂特异性差：试剂可能会与非目标物质发生反应，产生假阳性结果。

         E、操作错误：人为误差：检测人员在操作过程中出现错误，如样本处理不当、数据记录错误等。

              设备校准不当：检测设备未正确校准或维护，导致结果偏差。

         F、生物学因素：宿主因素：个体差异或宿主特有的生物学因素可能干扰检测结果。                                                                                    疾病因素：某些疾病或生理状态可能导致体内出现与目标物质类似的化合。

 

 

 

25、什么是假阴性？

         假阴性（False Negative）指的是在检测或诊断过程中，测试结果显示目标或条件不存在，但实际上目标或条件确实存在的情况。           这种错误的阴性结果可能导致漏诊、延误治疗或错误的安全判断。假阴性问题在各种检测方法和领域中都可能出现，包括医学                 诊断、环境监测、质量控制等。

 

 

26、如何避免假阳(阴)性的产生？

         A、提高检测方法的灵敏度：选择高灵敏度的检测方法和试剂，确保能够检测到低浓度的目标物质。

         B、优化样本处理：采取严格的样本采集、处理和储存措施，确保样本的代表性和稳定性。

         C、使用对照样本：在检测过程中使用阴性对照和阳性对照，帮助识别和排除假阴性结果。

         D、重复检测：对初次检测结果进行重复检测，确认结果的准确性。

         E、优化操作流程：培训检测人员，规范操作流程，减少人为误差。

         F、设备维护和校准：定期维护和校准检测设备，确保其准确性和稳定性。

 

 

 

27、核酸自动抽提的原理是什么？

         核酸自动抽提是一种高效、标准化的核酸提取方法，利用自动化设备从样本中分离并纯化核酸（如DNA和RNA）。这种方法广泛             应用于分子生物学研究、临床诊断、食品安全检测等领域。

 

28、什么是恒温扩增（Isothermal Amplification）？

        1.温度特点：恒温扩增技术在整个反应过程中保持恒定的温度，通常在60-65摄氏度之间。
        2.工作原理：恒温扩增通过特定的引物设计和酶系统，在恒温条件下，通过循环反应进行DNA的高效扩增。常见的恒温扩增技术包             括LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增）和RPA（Recombinase Polymerase                                     Amplification，重组酶聚合酶扩增）等。
        3.优势：操作简单，无需复杂的 温度控制设备；适用于迅速、高效地扩增DNA序列，特别是在野外或资源有限的条件下。  

 

29、什么是变温扩增（Temperature-cycling Amplification）？  

         1.温度特点：变温扩增技术通过在不同的温度阶段进行循环，通常包括变性、引物结合和延伸步骤。
         2.工作原理：典型的变温扩增技术是PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应），在每个扩增周期中，反应体系会经历              高温变性（解链）、低温引物结合和中等温度延伸的循环。
         3.优势：PCR 扩增具有高度的特异性和灵敏度，能够扩增极少量的DNA样本，并且在实验室设置中被广泛应用于基因组学研究、                临床诊断和分子生物学实验中。

 

 

30、恒温扩增和变温扩增的区别是什么？

         恒温扩增适用于需要简单操作和快速结果的场景，如快速诊断和野外检测。

         变温扩增（主要是PCR）则适用于需要高特异性和高灵敏度的实验室研究和临床诊断，但需要复杂的温度循环设备。