专家论坛：聚焦定量PCR

1.当定量PCR的CT值大于36时，如何进行结果判读？

定量PCR（qPCR）中的Ct值（Cycle threshold，循环阈值）代表在PCR扩增过程中检测到荧光信号的循环次数。Ct值越低，意味着初始样品中靶基因的数量越多；Ct值越高，说明初始样品中靶基因的数量较少。

当Ct值大于36时，一般表示样品中靶基因的数量非常低，接近检测限。具体来说，这可能意味着以下几种情况：

 

• 样品中靶基因含量极低：靶基因在样品中的含量非常少，几乎接近仪器的检测下限。

 

• 可能的假阳性结果：在Ct值非常高的情况下，偶尔会出现假阳性信号，这可能是由于非特异性扩增或其他实验误差引起的。

 

• PCR扩增效率问题：高Ct值也可能提示PCR反应的效率低，可能由于引物设计不佳、反应条件不理想或样品质量差等原因。

 

通常，当Ct值超过36时，结果的可信度可能不高，尤其是在低拷贝数样品或临界样品中，应结合其他实验数据和阳性对照进行综合判断。

 

2.定量PCR为什么用Ct来定量？有更好的定量方法吗？

 

定量PCR（qPCR）使用Ct值（循环阈值）来定量的原因在于它能够精确反映样品中靶基因的初始拷贝数。Ct值代表PCR扩增过程中检测到荧光信号的循环次数，通常在指数扩增阶段内测定。因此，Ct值与初始模板量呈现反比关系：初始模板量越多，Ct值越低；反之，初始模板量越少，Ct值越高。

 

为什么用Ct值定量？
敏感度高：Ct值能够检测到极低数量的靶基因拷贝数，适用于低丰度基因的检测。
快速和高通量：qPCR在短时间内可以处理大量样品，是高通量基因定量的理想工具。
定量精度：通过标准曲线法或比较Ct法，可以实现高精度的定量分析。
更好的定量方法
虽然qPCR的Ct值定量方法已被广泛应用，但也有其他定量方法，取决于具体的实验需求和技术条件；

 

绝对定量法：
数字PCR（Digital PCR, dPCR）：数字PCR是一种更精确的绝对定量技术，它将样品分成多个反应单元，通过统计阳性单元的数量来确定靶基因的绝对拷贝数。dPCR不依赖标准曲线，灵敏度和准确性更高，尤其适合低拷贝数基因的检测。
相对定量法：
比较Ct法（ΔΔCt法）：这是qPCR中另一种常用的相对定量方法，通过比较目标基因与内参基因的Ct值差异来计算相对表达量。
下一代测序（NGS）：
RNA-Seq：对于基因表达的定量，RNA-Seq是另一种强大的方法。它通过测序来定量全基因组范围内的基因表达，能够检测到极低丰度的转录本，并且不依赖特定的引物或探针设计。尽管成本较高，RNA-Seq可以提供非常详细的表达谱。
总体来说，qPCR中的Ct值定量方法已经被证明是可靠且高效的，但在追求更高精度或特定研究需求时，数字PCR或RNA-Seq可能提供更好的解决方案。

 

3.试剂盒的检测限是什么意思？一般定量PCR试剂盒的检测限是多少？

 

检测限（Limit of Detection, LOD）是指在特定条件下，检测方法能够可靠地识别和定量检测的最低靶分子浓度或数量。对于定量PCR（qPCR）试剂盒而言，检测限通常表示试剂盒能够检测到的最低靶基因拷贝数，并确保在这个水平上结果具有足够的可信度（通常要求至少有95%的置信水平）。

 

qPCR试剂盒的检测限
qPCR试剂盒的检测限因具体的试剂盒、靶基因、样品类型以及实验条件不同而有所差异。通常情况下，qPCR试剂盒的检测限在以下范围内：

 

拷贝数检测限：对于一些高敏感度的qPCR试剂盒，检测限通常在10至100个靶基因拷贝左右。一些非常敏感的试剂盒甚至可以检测到更低的拷贝数，接近1个拷贝。
浓度检测限：对于标准样品（如DNA或RNA），检测限可能被描述为ng/μL或pg/μL的浓度。例如，某些试剂盒可以在10 fg/μL或更低的浓度范围内检测到靶基因。

 

检测限的影响因素
qPCR试剂盒的检测限受到多个因素的影响，包括：

 

试剂盒的灵敏度：试剂盒中引物和探针的设计、酶的活性以及反应条件都会影响检测限的高低。
样品质量：样品中靶基因的降解程度、存在的抑制剂等都会影响检测限。
反应体积和样品输入量：增加反应体积或样品输入量可以降低检测限，但可能会引入其他变异。
PCR仪器的性能：不同PCR仪器的检测灵敏度和数据采集精度也会影响检测限。

 

检测限的重要性
在实际应用中，检测限是评估qPCR试剂盒性能的关键指标，尤其在疾病诊断、微量样品分析、环境监测等领域，了解和报告检测限是确保检测结果可信度的重要一环。

 

4.定量PCR常用的荧光染料有哪些？

 

定量PCR（qPCR）常用的荧光染料主要包括以下几种类型：

1）SYBR Green
特性: SYBR Green是一种非特异性染料，能够插入到所有双链DNA分子中，并在与DNA结合后发出荧光。随着PCR扩增过程中双链DNA的生成，荧光信号强度也会增加。
优点: 使用简单，适合各种靶基因的检测，不需要设计特异性探针。
缺点: 因为是非特异性染料，可能会与非特异性扩增产物（如引物二聚体）结合，因此需要良好的引物设计和产物熔解曲线分析来区分特异性扩增和非特异性产物。

2） TaqMan探针
特性: TaqMan探针是一种特异性探针，具有荧光报告基团（如FAM）和淬灭基团（如TAMRA）。在PCR扩增过程中，Taq DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性会切割探针，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，从而发出荧光。
优点: 高特异性，可以在同一反应中同时检测多个靶基因（多重qPCR）。
缺点: 需要设计和合成特异性探针，增加了实验成本。

3）EvaGreen
特性: EvaGreen是一种类似SYBR Green的染料，但具有更高的灵敏度和更低的毒性。它在与双链DNA结合时发出荧光，但与单链DNA和RNA的结合则很少。
优点: 比SYBR Green更加安全，且荧光信号更强，适合高灵敏度的检测。
缺点: 同样是非特异性染料，存在类似SYBR Green的非特异性扩增问题。

4） LC Green
特性: LC Green是一种高分辨率熔解曲线分析（HRM）中常用的荧光染料，具有高灵敏度，特别适合用于突变检测。
优点: 在HRM分析中能够精确区分不同熔解温度的PCR产物，适合突变筛查和基因分型。
缺点: 主要用于特定的HRM分析，不如SYBR Green和TaqMan探针那样广泛适用。

5） Molecular Beacons
特性: Molecular Beacons是一种环状探针，未结合时报告基团与淬灭基团靠近，不发荧光。当探针与特异性靶序列杂交时，环状结构打开，报告基团远离淬灭基团，从而发出荧光。
优点: 高特异性，适合检测特定的基因突变和单核苷酸多态性（SNP）。
缺点: 设计和合成复杂，成本较高。

 

这些荧光染料和探针的选择主要取决于实验的具体需求，如灵敏度、特异性、成本以及目标基因的复杂性。

 

5.如何比较定量PCR试剂盒的敏感性？

比较定量PCR（qPCR）试剂盒的敏感性通常需要从以下几个方面进行评价和实验设计，以确定其在检测低浓度靶基因时的性能：

 

1）. 检测限（Limit of Detection, LOD）
定义: LOD是能够可靠检测到的最低靶基因浓度或拷贝数。比较试剂盒时，LOD越低，表示其敏感性越高。

实验方法: 使用已知浓度的标准品或稀释的靶基因样品，逐步降低浓度至检测限，然后确定每个试剂盒的最低可检测浓度。

2）. 线性范围
定义: qPCR的线性范围是指在一定浓度范围内，靶基因浓度与Ct值之间保持线性关系的区间。
实验方法: 使用一系列已知浓度的靶基因进行扩增，绘制标准曲线（Ct值对数浓度作图），比较各试剂盒的线性范围。线性范围越宽，敏感性越好。

3）. 重复性和一致性
定义: 在同一试剂盒内或不同批次的试剂盒之间，对相同浓度样品进行多次测定，评估结果的一致性和重复性。
实验方法: 使用相同浓度的靶基因样品进行多次qPCR实验，计算Ct值的变异系数（CV）。较低的CV值表示重复性好，表明该试剂盒具有高敏感性。

4）. 特异性
定义: qPCR试剂盒的特异性是指它仅能扩增靶基因而不扩增非特异性产物的能力。
实验方法: 在含有复杂基因组背景或无靶基因的样品中进行qPCR扩增，观察是否产生非特异性信号。特异性高的试剂盒在背景复杂的样品中依然能够表现出良好的敏感性。

5）. 背景噪音
定义: 背景噪音指在没有靶基因的情况下，荧光信号的随机波动或假阳性信号。
实验方法: 在无靶基因的对照样品中进行qPCR扩增，评估背景噪音水平。背景噪音低的试剂盒通常具有较高的敏感性，因为它能更清晰地检测到低浓度靶基因的信号。

6）. 竞争性试验
定义: 在存在高浓度非靶基因序列的情况下，评估试剂盒能否仍然检测到低浓度靶基因的能力。
实验方法: 在靶基因与高浓度非靶基因共同存在的条件下进行qPCR扩增，比较不同试剂盒在竞争性环境中的检测效果。

7）. 熔解曲线分析（适用于SYBR Green染料）
定义: 熔解曲线分析能够评估扩增产物的特异性和纯度，从而间接反映试剂盒的敏感性。
实验方法: 通过qPCR后的熔解曲线分析，比较不同试剂盒的扩增产物的特异性。纯净的熔解曲线峰值表明特异性好，敏感性较高。

8）. 检测时间
定义: 在相同实验条件下，试剂盒检测到靶基因所需的循环次数（Ct值）。

实验方法: 对比同一靶基因样品在不同试剂盒中的Ct值。较低的Ct值意味着试剂盒可以更早检测到靶基因，表明其敏感性更高。

通过综合以上方法，研究者可以有效比较不同定量PCR试剂盒的敏感性，选择最适合实验需求的试剂盒。

 

6、胶体金检测抗体阳性，但定量PCR检测CT为38，结果如何判读？

当胶体金检测抗体阳性，而定量PCR（qPCR）检测Ct值为38时，结果的判读需要综合考虑多方面的因素：

1）. 胶体金检测结果解读

 

• 阳性结果：胶体金法检测抗体阳性通常表示样本中存在针对某种病原体（如病毒或细菌）的抗体。这表明被检测者曾经暴露于该病原体，或者正在对其进行免疫反应。

 

• 时间点的影响：抗体检测通常反映过去或正在进行的感染。IgM抗体阳性可能表示早期或正在进行的感染，IgG抗体阳性则可能表示过去的感染或恢复期。

 

2）. qPCR检测结果解读

 

• Ct值为38：qPCR的Ct值为38通常表示样品中靶基因的拷贝数非常低，接近或超过检测限。这可能是由于靶基因在样本中的浓度极低，或者是PCR反应效率较低。

 

• 结果的可靠性：在Ct值接近或超过35时，结果的可靠性可能较低，容易出现假阳性或假阴性。需要结合其他检测结果、临床症状和流行病学信息进行判断。
   

3）. 综合判读

 

• 可能的解释：

 

        1. 低水平感染：qPCR检测到微量病原体核酸（Ct值38），可能表示存在低水平的活跃感染，尽管病原体载量很低。抗体阳性提示曾经或正在进行免疫反应。

        2. 恢复期或残留病毒：患者可能已经过了感染高峰期，体内病毒水平下降，qPCR检测的Ct值较高，而抗体（尤其是IgG）阳性表示患者正在恢复或已经恢复。

        3. 假阳性或假阴性：qPCR的Ct值38接近检测限，可能存在假阳性或假阴性结果，需要进一步确认（如重复qPCR检测或使用其他检测方法）。

4）. 后续建议

 

• 重复检测：建议重新取样并重复qPCR检测，或者使用其他样本类型（如鼻咽拭子、痰液等）进行qPCR检测，以确认结果。

 

• 结合临床和流行病学信息：综合患者的临床表现（如症状、体温等）、流行病学史（如接触史）以及其他检测结果（如影像学检查），做出更全面的判断。

 

• 随访和进一步检测：如果仍然怀疑感染，建议随访患者，可能需要进一步的检测或监测抗体水平的变化。

 

综上所述，胶体金检测抗体阳性与qPCR Ct值38的结果需结合实际情况综合判断，不能单一依赖某一项检测结果来做出最终的诊断。

 

7、什么是冻干微球技术？

冻干微球技术是一种将液态的生物活性物质、化学试剂或药物溶液通过冷冻干燥的方法制成固态微球状颗粒的技术。这项技术通常用于制备稳定、易于保存和运输的生物制品或药物制剂。
 

冻干微球技术的过程
 

配制溶液：首先，将待冻干的物质溶解或分散在适当的溶剂中，形成均匀的溶液或悬浮液。常见的物质包括蛋白质、酶、抗体、疫苗、化学药物等。
 

• 形成微球：通过喷雾干燥、乳化、滴定等方法将溶液分散成均匀的小液滴，这些液滴随后被冷冻成固态颗粒。

 

• 冷冻干燥：将液滴快速冷冻，然后在低温低压环境下进行升华干燥，使液态溶剂（通常为水）直接从固态转变为气态，最终形成干燥的微球。

 

• 收集与包装：干燥后的微球通过筛分等工艺进行收集，并包装在适当的容器中，以便于保存和使用。
   

冻干微球技术的优点

 

• 稳定性：通过去除水分，冻干微球能够显著提高生物活性物质或药物的稳定性，延长其保质期。

 

• 便捷性：微球形式的制剂通常体积小、重量轻，易于包装、运输和存储。使用时可以方便地重新溶解或复溶。

 

• 均匀性：微球的大小和成分可以通过工艺控制，确保每一粒微球的剂量和成分一致，保证制剂的均匀性和可重复性。

 

• 保护活性：冻干过程可以在低温下进行，减少热敏感成分的降解，保护生物活性物质的功能。

 

• 应用广泛：冻干微球技术适用于多种物质的制备，包括疫苗、诊断试剂、药物、蛋白质、酶等。

冻干微球技术的应用

 

• 生物制品：用于制备稳定的疫苗、抗体、酶、蛋白质等生物制品，确保在运输和储存过程中保持活性。

 

• 药物制剂：制备长效药物、缓释药物或口服固体制剂，确保药物在体内的持续释放。

 

• 诊断试剂：用于生产稳定的诊断试剂，如qPCR试剂、酶标记物等，方便临床检测。

 

• 食品与保健品：在食品和保健品中应用，生产稳定的营养补充剂或功能性成分。

总结

冻干微球技术是一种通过冷冻干燥制备微球状固态颗粒的方法，广泛应用于生物制品、药物、诊断试剂等领域。它能够显著提高制品的稳定性、便捷性和均匀性，是现代制剂技术中的重要组成部分。